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研究进展探寻脑卒中免疫治疗靶点




  对于脑卒中治疗靶点的探索一直以来从未中断,结合免疫治疗的最新热点——Treg细胞,李佩盈研究员在2019年浦江国际麻醉与危重病论坛,详细介绍了课题组在脑卒中免疫治疗中的研究成果与进展。




确立研究方向:缺血性卒中治疗



  缺血性卒中具有发病率高、致死性高、致残性高的特点,而且中国是缺血性卒中发病的重灾区。目前,脑卒中的有效治疗手段包括药物治疗和手术治疗,其中药物治疗手段主要是运用重组组织型纤溶酶原激活剂(rtPA)进行溶栓,而手术治疗则主要指血管内机械性取栓等。无论患者采取哪种治疗手段,后续都会产生一系列继发性神经损伤,即外周免疫细胞激活造成的免疫性神经损伤。因此,课题组确立了研究方向——缺血性卒中的免疫治疗,并希望通过后续研究,探寻免疫治疗的靶点。


  基于以上背景,课题组开展了系列研究,希望能够通过调控神经炎症进程进行脑卒中的治疗。在2018年12月发表在《CNS neurosci Ther》、题为“The peripheral immune re -sponse after s troke-A d oubleedge sword for blood-brain barrierintegrity”的综述中,通过梳理缺血性卒中后不同外周免疫细胞激活免疫性神经损伤的相关研究,笔者发现,不同的外周免疫细胞对于脑卒中治疗是一把双刃剑,其或保护或损伤血脑屏障。因此,了解免疫细胞激活的免疫反应,进一步明确发挥或损伤作用的信号分子,可以帮助寻找脑卒中的免疫治疗新靶点,为脑卒中治疗开辟新方向。




Step1 明星细胞Treg



  在诸多不同的外周免疫细胞中,课题组首先注意到Treg这一明星细胞。Treg细胞是一种具有免疫抑制作用的调控因子调节性T细胞,主要由幼稚T细胞发育而来。目前,Treg细胞在肿瘤、心血管疾病、神经认知功能障碍等领域,备受瞩目。


  Liesz A教授等最先开始进行Treg细胞在脑卒中治疗中的研究。2009年,Liesz A等人发表在《Nat Med》、题为“Regulatory T cells arekey c erebroprotective immunomodulatorsin acute experimentalstroke”的研究,主要分析了关键的免疫调节剂CD4+、CD25+等对于Treg细胞的作用。研究结果表明,①Treg细胞的耗竭大大地增加了延迟性脑损伤和功能恶化,同时,Treg 细胞的缺乏增强了小胶质细胞和T细胞的缺血后激活,而这两种细胞分别是有害的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)的主要来源。早期的TNF-α拮抗作用和IFN-γ的延迟中和作用阻止了Treg细胞耗竭的小鼠梗死面积的增长;②脑内白介素(IL)-10可消除Treg细胞耗竭后细胞因子的过度表达并阻止了继发性梗死面积的增长,而输注移植模型中IL-10缺陷Treg细胞的转移是无效的。


  Liesz A教授等人得出结论:Treg细胞与多种炎症反应途径相关,对于缺血后脑卒中炎症反应具有神经保护作用,IL-10信号传导在Treg细胞的免疫调节中至关重要。




Step2 Treg的神经保护机制



  由于Treg细胞仅占CD4+T细胞数量的5%,数量极少的Treg细胞却能发挥如此强大的免疫抑制功能,由此课题组推测,当Treg细胞数量达到一定程度时,其对于脑卒中后神经炎症反应的治疗作用,就可想而知了。


  基于此,课题组继续开展动物实验验证上述推测,同时进一步讨论Treg细胞的神经保护机制。2013年发表在《Ann Neurol》、题为“AdoptiveRegulatory T-Cell Therapy pro -tects against cerebral ischemia”的研究中,课题组将Treg细胞通过静脉系统注入小鼠体内,评估Treg细胞对脑损伤小鼠的神经保护功能。研究结果表明,在大脑中动脉阻塞后2、6,甚至24小时内,全身使用纯化的Treg细胞,可显著减少脑梗死面积,并可延长神经功能改善时间至4周。


  得出结论:Treg细胞早期治疗不仅可以显著减少缺血后梗死的脑组织面积,并且可以改善缺血后的血脑屏障损伤程度,由此增加血脑屏障的完整性。



  深入思考1:Treg是否增加免疫抑制风险?


  Treg 细胞的免疫抑制性引发了课题组的担忧。脑卒中后患者会出现免疫抑制状态,可能会增加发生肺炎等感染性疾病风险,从转化角度考虑,如果将免疫抑制性的Treg细胞输入患者体内,是否会加重脑卒中后的免疫抑制反应风险?同年,发表于《Stroke》、题为“Adoptive Regulatory T-Cell Therapy Preserves Systemic Immune Homeostasis After Cerebral Ischemia”的研究中,课题组将具有免疫抑制功能的细胞输入脑卒中后小鼠体内后发现,Treg细胞不仅没有加重小鼠的免疫抑制,反而改善了小鼠的免疫抑制功能,是一种有益的免疫状态。课题组认为,这与Treg 细胞减少了外周T细胞的激活有关,此研究结果也打消了关于Treg细胞增加免疫抑制风险的顾虑。



  深入思考2:Treg是否在卒中早期进入脑组织?


  课题设计之初,课题组猜想,Treg细胞进入中枢系统对脑组织发挥神经保护作用,但是,在后期反复的实验中,课题组并未在卒中早期的脑组织中找到Treg细胞。随后,通过流式细胞分析、免疫荧光染色等方法才发现,Treg细胞在卒中早期并未进入脑组织。那么Treg细胞是如何在外周对缺血脑组织起到神经保护作用的?这个问题一直困扰着课题组,同时,也推动着相关研究的进展。




Step3 Treg与中性粒细胞



  为了继续探究血脑屏障的保护机制,课题组进行了不同的细胞标志物实验,发现Treg细胞可以减少金属基质蛋白酶(MMP)-9的表达,而中性粒细胞是MMP-9的重要细胞来源。Treg 细胞来源于获得性免疫系统,而中性粒细胞来源于先天性免疫系统,这两者是如何产生相互作用的?



  PD-L1 介导抑制MMP-9分泌


  Treg 细胞抑制MMP-9的表达实现了血脑屏障的保护功能,而Treg细胞与中性粒细胞(MMP-9 主要细胞来源)的相互作用,也引发课题组的关注。课题组在2014年发表于《Stroke》、题为“Essential Role ofProgram Dea th 1-Ligan d 1 inRegulatory T-Cell-Afforded ProtectionAgainst Blood-Brain BarrierDamage After Stroke”研究中,使用允许细胞间接触的transwell系统或共培养系统进行试验。在小鼠中诱导局灶性脑缺血60分钟,从供体小鼠中分离Treg细胞,在脑中动脉闭塞后2小时静脉注射到缺血受体中。在脑中动脉闭塞(MCAO)1或3天后评估MMP-9的产生、血脑屏障通透性和脑梗死情况。实验中,研究者利用Treg细胞上不同的免疫抑制性标志物来阻断其免疫抑制分子,最终筛选到PD-L1分子,而中性粒细胞上便存在PD-L1的受体。


  体外研究结果表明,Treg细胞介导的中性粒细胞MMP-9抑制作用需要细胞间的直接接触。当用PD-L1中和抗体预处理Treg细胞或用PD-L1抗体预处理中性粒细胞时,MMP-9的抑制作用被消除。同时,体内研究证实,用PD-L1抗体预处理的Treg或从缺乏PD-L1的小鼠中分离的Treg细胞的静脉内输注不能抑制MCAO 60分钟后的血液中性粒细胞产生MMP-9。此外,MCAO后的血脑屏障损伤在PD-L1适应性Treg细胞治疗的小鼠中得到了大大改善,而PD-L1受损的Treg细胞治疗的小鼠却没有得到改善。可以看出,PD-L1功能障碍消除了Treg细胞介导MCAO后3天的脑保护和神经系统的改善作用。


  综上,Treg细胞可以通过与中性粒细胞上的PD-L1受体相互作用,抑制中性粒细胞MMP-9的分泌,在脑卒中缺血后起到神经保护作用。




Step4 Treg与内皮细胞



  Treg细胞抑制中性粒细胞分泌MMP-9的机制现已明确。同时,在上述共培养实验中,两种细胞之间的相互作用是通过直接接触实现的,而非通过细胞间可溶性介质释放。那么,这两种细胞具体接触部位在哪里呢?


  2017年发表在《JAHA》、题为“c-c Chemokine Receptor Type 5(CCR5)-Mediated Docking of Transferred Tregs Protects Against Early Blood-Brain Barrier Disruption After Stroke”的文章中,课题组揭示了CCR5 在脑卒中后免疫调控的新机制。


  双光子实时成像显示,CCR5对于Treg细胞停靠在受损血管壁上的时间至关重要,在脑缺血损伤后,CCR5与血液中的中性粒细胞或巨噬细胞相互作用。当敲除Treg细胞上的CCR5受体时,Treg细胞与血管内皮细胞和中性粒细胞的接触时间明显减少。


  同时使用流式细胞仪,实时聚合酶链反应和免疫染色,课题组证实了脑缺血后受损的内皮细胞CCL5(CCR5配体)的表达显著升高,同时外周细胞内Treg细胞上的CCR5上调。在Treg- 内皮细胞共培养物中,当Treg细胞暴露于缺血损伤的内皮细胞时,CCR5表达被诱导。此外,CCR5在Treg细胞上的诱导增强了PD-L1的表达,从而抑制了MMP-9。


  CCR5的发现使得课题组揭开了谜题,发现脑卒中早期免疫调控新机制:CCR5受体活化上调PD-L1受体,增强Treg细胞对中性粒细胞的抑制作用。




Step5 CCL2和MMP-9介导Treg神经保护



  Treg细胞在脑卒中早期血脑屏障保护作用在上述研究中已经明确,为继续探索其是否减少tPA溶栓后的脑出血风险,进一步提高溶栓安全性,课题组于2017年发表在《Brain》、题为“Regulatory T cells amelioratetissue plasminogen activator-inducedb rain h aemorrhage af ter stroke”的文章,评估了Treg细胞在tPA溶栓引起的脑出血的作用,并探讨了作用机制。


  首先,临床研究结果表明,相较于未溶栓者,tPA溶栓患者外周Treg细胞数量减少更明显且不易恢复。由此推测,脑卒中患者的外周Treg细胞数量提升可能增强其血脑屏障保护作用。


  接着,回到动物实验中,课题组建立了小鼠tPA溶栓模型,探究移植输注的Treg细胞对小鼠血脑屏障的保护作用。研究发现,Treg细胞不但可以直接抑制MMP-9分泌,还可以抑制血管内皮细胞趋化因子2(CCL2)的表达,从而保持血脑屏障的完整性。这项研究结果意义重大,表明Treg细胞治疗可以保护tPA溶栓治疗小鼠的血脑屏障,有望延长脑卒中患者tPA 溶栓治疗的时间窗,从而减少溶栓带来的不利影响,让更多患者从tPA溶栓治疗中获益。




Step6 肿瘤合并脑卒中的免疫治疗



  合并肿瘤的患者围术期发生脑卒中的风险大,但是Treg细胞在肿瘤学研究领域中一直被认为是促进肿瘤发生发展的细胞。这种矛盾促使Treg细胞对于肿瘤合并脑卒中患者的治疗靶点研究成为热点。


  为此,课题组建立了肿瘤合并脑卒中的小鼠模型,并于2018年在《Stroke》刊文,探讨了Treg细胞在动物模型中的具体作用。研究表明,脑卒中后Treg细胞上Nrp1受体(一种血管生长因子受体,VEGF受体)表达上调,Treg细胞更多向肿瘤组织募集,而非损伤的脑组织的募集,即在肿瘤合并脑卒中时,Nrp1会介导Treg细胞向肿瘤募集,会加重肿瘤合并状态下的缺血性脑损伤。课题组推荐,如果可以调控Nrp1信号表达,阻断其向肿瘤组织的募集,促进其向受损脑组织的募集,那么这代表Nrp1可有望成为脑卒中合并癌的有希望的免疫调节靶点。




Step7 脑卒中后期Treg神经保护



  上述研究中,笔者团队讨论了Treg细胞的在脑卒中早期的神经保护情况,事实上,脑卒中后的神经炎性反应不仅存在于早期,也持续存在于后期。因此,课题组也开展了关于脑卒中后期炎症反应的作用的课题研究。



  CD8+T 细胞脱髓鞘损伤


  课题组于2019年发表在《CNSNeurosci Ther》、题为“L-2mAbreduces demyelination after foca lcerebral ischemia by suppressing CD8+ T cells”的文章为脑卒中长期神经功能损伤提出了新的免疫机制学。


  起初,研究人员试图寻找Treg细胞对于卒中后期的神经保护作用,但未有明显发现,却意外发现了IL-2单克隆抗体(IL-2mAb)可以抑制CD8+T细胞激活。由CD8+T细胞是抗原抗体T细胞,可加重脑卒中后期脱髓鞘病变,研究人员在MCAO术后2、4、8小时腹腔注射IL-2mAb 或IgG同型抗体(0.25mg/kg)。采用2,3,5-三苯基三唑氯染色、免疫荧光染色、流式细胞术和Western blot检测梗死面积、周围免疫细胞浸润、小胶质细胞活化和髓鞘丢失。术前1天腹腔注射CD8+中和抗体(15mg/kg),观察CD8+T细胞在脱髓鞘病变中的作用。


  研究发现,在IL-2mAb处理的小鼠中,CD8+T细胞的脑浸润和CD8+T细胞的外周活化均减弱。IL-2mAb对脑卒中后1周CD8+T细胞耗竭小鼠脱髓鞘的保护作用被破坏。因此,IL-2mAb保障了脑缺血损伤后的白质完整性,改善了长期的感觉运动功能。CD8+T细胞的活化和脑浸润对脑卒中后脱髓鞘是有害的,可能是IL-2mAb治疗后保护脑卒中后期白质完整性的主要靶点。

Treg 细胞抑制神星形胶质细胞


  殊途同归,Akihiko Yoshimura等人2019年于发表在《Nature》的文章也指出,Treg细胞在脑卒中后更为长期的保护作用。研究发现,脑卒中后期小鼠大脑中存在大量Treg细胞的浸润,并随着时间的延长,数量逐渐增多;Treg细胞通过产生一种低亲和力表皮生长因子受体(EGFR)配体双调节蛋白抑制神经毒性星形胶质细胞,促进了神经功能的恢复。如果消除脑卒后大量浸润的Treg细胞,将会引起小鼠后期的行为学功能转变。因此,Treg细胞在脑缺血损伤后存在长期作用,可能为脑损伤后期神经保护提供治疗机会。




Step8 影响Treg细胞的分化因素



  Treg细胞的神经保护作用已明确,但究竟是什么因素让幼稚型T细胞分化为Treg细胞而非Th17细胞呢?



  Treg 细胞分化调节机制


  抑制ACC1 可促进Treg细胞转化 乙酰辅酶A脱羧酶(ACC1)是幼稚型T细胞向Treg细胞分化重要的免疫代谢调控靶点,最后的分化类型主要取决于T细胞所处微环境的能量状态。笔者研究表明,微环境中能量越低,T细胞就越向抑制炎症细胞的方向转化,因此抑制ACC1 可以抑制人和小鼠Th17细胞形成,并且促进Treg细胞转化。


  卒中后外周CD4+T细胞的代谢改变 课题组分析了脑卒中或非卒中小鼠的外周CD4+T细胞代谢,观察其代谢产物。研究发现与非卒中小鼠相比,脑卒中小鼠代谢水平增加,脑卒中后外周T 细胞的糖酵解压力和脂肪酸合成增加。


  特异性敲除ACC1对脑卒中的影响 脑卒中后T细胞内ACC1的表达上调,当研究者敲除ACC1条件性基因后,虽然并未影响脑血流,却明显减少了卒中后梗死脑组织面积和T细胞向脑组织的浸润。在细胞分化方面,特异性敲除ACC1条件性基因可促进Treg细胞分化,从而增加对脑卒中的神经保护作用。



  调控ACC1 的方法


  关于调控ACC1,课题组发现,限食(限制卡路里摄入)可明显减少外周T细胞内ACC1的表达。但是如果对ACC1条件性基因已经敲除的小鼠进行限食,则对于脑梗死面积变化及Treg 和Th17分化作用不明显。Sor-A(Soraphen,AAC1特异性抑制剂)可用于ACC1的药物调控,抑制ACC1活性,从而减少脑梗死面积,改善脑卒中后的神经炎症反应及脑损伤(《Stroke》,2019)。






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