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睡眠、镇静和体温调节的重叠机制

 

  理想的全麻药应当仅仅引起意识丧失、镇痛和遗忘,但事实上,几乎所有的全麻药都会引起体温降低,而且体温改变的机制一直没有阐明。睡眠过程同样引起体温降低,这也解释了麻醉与睡眠可能涉及相同神经通路的理论。Nick Franks教授基于两项最新研究,深入阐述了睡眠、镇静和体温调节的重叠机制。

 

 


  右美托咪定诱导镇静与睡眠的机制

 


  研究背景——镇静剂是否参与了自然的睡眠途径?

 

  研究者通常将翻正反射(LORR)消失作为睡眠开始的指标,麻醉诱导的镇静和LORR都是通过影响脑区同一神经通路而产生的,两者的不同之处在于影响脑区神经通路的范围大小。cFOS蛋白是即刻早期基因cFOS转录翻译的产物,其是一种核内磷酸化蛋白。基础状态下,中枢神经系统中cFOS蛋白水平非常低,然而在各种应激状态下,cFOS蛋白的表达能够被瞬时快速诱导,由于这一特性,其常被作为神经元激活的标志。另有相关研究表明,α2肾上腺素能受体激动剂右美托咪定诱导的镇静类似于睡眠剥夺后的深度恢复性睡眠。基于上述理论基础,Nick Franks教授及其同事通过cFOS蛋白标记右美托咪定诱导镇静或恢复性睡眠时下丘脑视前区激活的神经元,然后选择性地重新激活标记神经元,在此基础上检测不同脑区的cFOS表达,旨在揭示镇静药物、麻醉与睡眠机制的相关性。研究结果于2015年发表在《Nature Neuroscience》。

 


  研究结果——右美托咪诱导定镇静和恢复性睡眠神经通路相似


 


  上述研究于2015年发表在《Nature Neuroscience》,我们来看一下研究结果。如图1所示,图1b中黑点代表cFOS阳性细胞,图b分别显示了注入盐水后30分钟、注射右美托咪定(100μg/kg)后30分钟、注射右美托咪定(100μg/kg)后60分钟、睡眠剥夺后恢复性睡眠2小时的cFOS蛋白表达。通过对照我们不难发现,cFOS蛋白在给予镇静剂右美托咪定或恢复性睡眠后在下丘脑有广泛表达。

 

  图1c显示了经生理盐水注射(白色)、右美托咪定注射(红色)、恢复性睡眠(灰色)后,在下丘脑腹外侧视前核(VLPO)、下丘脑外侧视前区(LPO)等部位的cFOS阳性神经元数目。从cFOS表达时间和位置来看,右美托咪定诱导的镇静状态和恢复性睡眠的神经通路有着显著相关性。

 


  研究结果——CNO重新激活镇静和恢复性睡眠标记的神经元


 


  如图2所示,图2a代表实验方法。由于cFOS仅表达在激活的神经元中,因此,cFOS可以作为启动子驱动tTA蛋白表达。研究者首先标记了在右美托咪定诱导的镇静过程或恢复性睡眠中激活的下丘脑视前区的神经元,然后使用人M3毒蕈碱受体(hM3Dq)受体及其配体氯氮平-N-氧化物(CNO),使这些标记神经元被选择性地重新激活。

 

  图2b代表实验过程。实验初注射腺相关重组病毒(AAV),在为期四周的表达过程中,连续给予小鼠多西环素(DOX)饮食抑制下游蛋白的表达。而后在不同的右美托咪定、DOXCNO作用条件下,选取六个时间点分析小鼠大脑冠状切面的hM3Dq-mCherry表达结果。

 

  如图2c所示,在DOX的作用下,tTA不能结合并激活其目标启动pTRE-tight,去除DOX后,tTA可以激活hM3Dq-mCherry表达,但仅在由cFOS启动子驱动的tTA表达的神经元中激活,反映神经活动。

 


  研究结果——CNO重现镇静作用及恢复性睡眠




  研究者通过在饲养小鼠的笼子中投入弹珠一类的玩具来吸引小鼠的注意力,在4小时内保持小鼠清醒,即进行睡眠剥夺。当睡眠剥夺停止之后,小鼠进入恢复性睡眠状态。之后通过脑电监测,观察小鼠睡眠过程中的脑电图(EEG)、肌电图(EMG)情况。通过图3不难发现,CNO重新激活标记的神经元后,可以再现右美托咪定的诱导镇静作用和恢复性睡眠。

 

  如图4所示,LPO-TetTag-hM3DqMnPO-Tet-Tag-hM3Dq小鼠脑电图和肌电图信号被标记为睡眠(红色)、苏醒(黑色),EEG波形显示小鼠已进入深度睡眠,处于非快动眼睡眠(NREM)状态。值得注意的是,该特征性波形几乎与镇静状态的脑电波形一致。小鼠在恢复性睡眠中睡眠时间增加,体动减少,δ波增加,这也与右美托咪定诱导镇静的实验结果相似。与此同时,由CNO重新激活被cFOS标记的神经元后得到的睡眠状态、脑电特征也和该实验结果一致。

 


  研究结果——CNO重现体温下降

 



  右美托咪定是作用于α2肾上腺素能受体的镇静剂,在小鼠去掉γ-氨基丁酸(GABA)神经元后,其原来的诱导镇静作用被大大削弱。

 

  如图5所示,无论是给予右美托咪定镇静还是处于恢复性睡眠状态,LPO-TetTag-hM3DqMnPO-TetTag-hM3Dq小鼠体温均显著下降,但是在CNO重新激活被cFOS标记的神经元时,仅在右美托咪定诱导镇静后的LPO-TetTag-hM3Dq小鼠体温降低。

 

 


睡眠与体温调控机制

 


  由于先前引起小鼠体温降低的神经通路未行进一步地阐明,关于镇静、睡眠、体温降低三大方向的重叠机制研究仍在继续。近期Nick Franks教授及同事在下丘脑同一区域成功地将调控睡眠与体温的神经元分离,找到了麻醉导致体温降低的关键神经通路,最新研究进展于2018年发表在《Current Biology》。

 


  研究结果——小鼠睡眠环境温度选择

 



  研究者通过外部温度刺激的变化,而不是采用麻醉药的方法来研究小鼠体温下降的神经通路。研究者在饲养小鼠的笼子两端分别设定22℃±1℃、32℃±1℃的温度选择,观察老鼠偏好于何种温度。如图6B所示,小鼠更趋向于温暖的睡眠环境。

 


  研究结果——热刺激导致睡眠和体温下降

 



  在之前温度偏好测试时,小鼠偏好明显,表现为在接近热中性区的温度下进入睡眠状态。研究者在基于cFOS活性标记下验证了相关假设,即热刺激通过下丘脑正中视前核和视前内侧核区域(MnPO-MPO)诱发NREM睡眠。因此,该实验方案和2015年的一致,研究者采用CNO重新激活MnPO-MPO区域的神经元,给予不同的温度刺激,再使用DOX,最后验证CNO的重新激活作用。

 

  在图7A中,研究者给予小鼠32℃的热刺激时,小鼠MnPO-MPO区域有大量的cFOS表达,可用于激活标记神经元。经过热刺激后给予CNO,重新激活标记神经元,小鼠体温下降,进入睡眠状态。结果显示,小鼠的核心体温变化很小,外周温度变化显著。

 



  图8F是没有经过热刺激的小鼠(对照组),图8G是过热刺激之后再给予CNO的小鼠(实验组)。图8显示了小鼠在睡眠阶段肌电图、脑电图、脑电特征的变化。其中,蓝色表示清醒状态,绿色表示睡眠状态。如图8所示,对照组小鼠呈现出自然片段的睡眠,而实验组则很快进入长时间的深度睡眠。

 


  研究结果——体温调控神经元

 

  研究者通过CNO激活标记的MnPO-MPO区域神经元,同时记录热刺激下小鼠的核心体温和脑电图。由标记神经元活动的实验结果可知,热刺激会激活MnPO-MPO区域的一氧化氮合酶能(NOS1)、谷氨酸能和GABA能神经元,进而引发体温下降和NREM睡眠。

 

  调控体温的神经元是什么?为进一步研究MnPO-MPO区域神经元的神经化学特性,研究者将这些神经元进行染色并分类重新激活。在MnPO-MPO下丘脑中重新激活热刺激标记的NOS1能、谷氨酸能神经元可诱导NREM睡眠和体温下降,而在MPO中标记的GABA神经元仅产生NREM睡眠。

 

  体温调控神经元是GABA神经元还是NOS1神经元?泛活动标记法不能区分神经元的亚型。为检验和区分NOS1表达和GABA神经元群体的特定作用,研究者将标记活动限制在遗传指定的细胞类型,以便pTRE-tighthM3Dq-mCherry转基因的表达。

 

  研究结果表明,无论是激活MnPO-MPO下丘脑中的热刺激标记的GABA还是NOS1神经元都会导致睡眠,但是只有NOS1神经元有降低体温的作用。

 

  既往研究表明,调节睡眠和体温的神经元是不同的。上述研究证实,外周受到温度刺激之后,外周神经元将神经冲动经脊髓传递到下丘脑,激活LPO区域的NOS1、谷氨酸能神经元,此处神经通路可分为两部分:第一,在中间的视前区表达,通过GABA神经元直接抑制觉醒,导致NREM睡眠;第二,在下丘脑外侧区抑制NOS1、谷氨酸能神经元,在导致NREM睡眠的同时降低体温。由此可见,GABA神经元位于NOS1/谷氨酸能神经元的下游,并且在下丘脑视前区的位置,有一部分神经元既调控体温又控制睡眠。

 



  未来展望

 


  睡眠表现为机体运动活动停止、肌肉松弛、意识消失、新陈代谢下降,并且允许在能量消耗最小的条件下保证机体的基本生命活动。相关研究显示,睡眠不仅仅是简单的活动停止,更是维持高度生理功能的适应行为和生物防御技术所必需的状态。拥有良好的睡眠,觉醒时才能高度发挥大脑信息处理功能的能力。在探求精神和意识,学习和记忆等脑高级功能时,无疑睡眠占有重要地位。

 

  VLPOLPO区域的GABA神经元是机体睡眠发生和维持的依赖和基础。由于睡眠也是一种可逆转状态,常可在“瞬间”完成睡眠和觉醒的转换,麻醉或昏迷状态与睡眠截然有别,不具备瞬间唤醒的特性。因此,彻底阐明睡眠、麻醉药镇静发生和调节的机制是根本途径,也是众多学者不断努力和追求的目标。




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