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脊髓上行特异激活延髓On细胞调节疼痛发生的新神经环路



  疼痛与麻醉是麻醉学科在临床十分关注的两个重要话题。关于全麻机制的研究已经持续了数十年,虽然目前仍然机制不明,但是在临床实践中,不同麻醉方式和麻醉药物的使用却能达到很好的麻醉效果;相反,关于疼痛发生和调节的相关机制已有“门控学说”、“神经基质理论”、“疼痛与神经可塑性”等众多学说和理论,临床上也有如“McGill疼痛问卷”、“简明疼痛评估量表”等诸多方法评价疼痛程度。但是,如何在临床中很好地进行疼痛管理,如何早期识别慢性疼痛,如何控制慢性疼痛并减少镇痛药物的副作用等问题却仍然困扰着广大临床医生。

 

 


经典的疼痛神经环路

 


  外周伤害性刺激通过外周传入神经,经过背根神经节,再由脊髓背角上行,经过脑干等结构到达前额叶皮层等疼痛相关脑区,再通过由中脑导水管周围灰质(PAG-延髓头端腹内侧区(RVM)组成的下行调节系统进行疼痛的下行易化或抑制调节,这是疼痛发生和调控的经典神经环路。RVM区作为中枢神经系统中疼痛调节的最后一道“闸门”,在疼痛研究中占据重要地位。探究RVM区神经元的分类和构成,明确特异性调控相关神经元对疼痛发生和疼痛感受的作用,或许能为临床上疼痛管理提供一些相应的理论基础和实践方向。

 

 


RVM区On细胞和Off细胞对疼痛的重要作用

 


  既往研究表明,抑制静脉注射内源性大麻素类药物,RVM区功能就能反转,防止出现痛觉过敏的作用,且对动物的运动功能并不会造成影响;而在内脏痛觉过敏模型的大鼠RVM区,注射极低剂量的吗啡,就能产生持久的镇痛作用。这充分说明,RVM区是阿片类药物发挥镇痛作用的重要区域。RVM区的神经元根据电活动与疼痛的关系,可以分为三类:On细胞、Off细胞和Neutral细胞。当出现疼痛刺激时,On细胞会出现放电的突然增加,Off细胞会出现放电的突然减小,而Neutral细胞的电活动没有明显的变化。鉴于On细胞和Off细胞是和疼痛密切相关的两类细胞,对其进行特异性调控,以明确其在疼痛发生及调控中的关键作用便至关重要。然而,自1983Fields等发现On细胞和Off细胞的数十年以来,依然未能实现特异性调控,制约这一研究的关键因素,或许是缺乏On细胞或者Off细胞特异性的表面标志物。

 

  基于上述理论及研究,俞卫锋教授团队进行了动物实验,旨在探索On细胞的表面标志物及其在疼痛发生和调节神经环路中的作用。首先,通过在体电生理记录和神经生物素标记的方法,实现On细胞和Off细胞的荧光标记,进一步进行雌激素受体(GPER1)、色氨酸羟化酶(TPH)以及μ阿片受体(MOR)的免疫荧光染色分析,研究者发现GPER1On细胞完全共标,与Off细胞完全不共标,GPER1可能是On细胞的特异性标志物。On细胞为非5-羟色胺(5-HT)的神经元,且存在μ阿片受体,这可能和阿片类镇痛作用机制有关。

 

  鉴于GPER1On细胞的密切关系,研究者对GPER1的细胞亚结构定位和是否与疼痛行为相关进行了进一步研究。利用神经元标志物NeuN、内质网标志物KDEL和高尔基体标志物TG分别与GPER1进行免疫荧光染色分析,发现GPER1特异性表达在神经元的高尔基体上。通过在RVM区给予不同剂量的雌激素,研究者发现,雌激素能剂量依赖性地增强On细胞放电并减弱吗啡对On细胞的抑制作用,但是对Off细胞没有影响,而给予GPER1特异性拮抗剂G15后,雌激素所导致的RVM区神经元去极化作用便消失了。

 

 


特异性调控On细胞对疼痛行为的影响

 


  如果GPER1确实为RVMOn细胞的特异性标志物,那么这将为特异性调控On细胞提供新方法。为了进一步利用GPER1进行对On细胞的特异性调控,研究者利用CRISPR-Cas9技术构建了GPER1-Cre小鼠。其后,研究者利用立体定位注射技术,将pAAV-hSyn-DIO-ChR2-mCherry的光遗传病毒注射至GPER1-Cre小鼠的RVM脑区,这样,便实现了使得表达Cre的神经元才能转染ChR2元件,从而可以进行对GPER1阳性细胞的特异性调控。初步的光遗传行为学实验发现,当给予5mW20Hz的蓝光刺激后,小鼠出现了短暂的类似“僵直状态”的行为表现。光遗传技术调控GPER1标记的On细胞似乎不能在生理情况下直接诱导出现“回缩反应”,或许可能诱导出现类似内脏痛的自发疼痛,从而表现为“僵直状态”。此外,研究者还构建了Cre重组酶诱导表达白喉毒素的病毒(pAAV-mCherry-flex-dtA),此病毒可以特异性杀死GPER1-Cre的神经元。相应的行为学实验表明,实验组比对照组出现了热痛阈的升高。研究者进一步使用全弗氏佐剂构建炎性痛的疼痛模型,与对照组相比,实验组缩爪潜伏期明显延长,热痛觉过敏现象也比对照组出现的更为缓慢。为此,研究者初步认为,RVM区的On细胞可易化外周疼痛,但对基础状态下的自发疼痛反应可能并无影响。

 

 


下行调节系统的激活

 


  随着疼痛刺激的发生,OnOff细胞会出现电活动的变化,且此变化先于疼痛相关行为反应。On细胞和Off细胞作为RVM区的神经元,参与疼痛的下行调节系统,那么为何下行调节系统在疼痛发生时需要激活呢,下行调节系统又是如何被激活呢?研究者利用AAV2/retro型病毒能够逆行示踪的原理,在RVM区注射此病毒以寻找位于脊髓的负责上行直接投射至RVM区的神经元。经过取材切片验证,在vlPAG区和脊髓均可以看到被标记出来的神经元。总所周知,PAG存在诸多下行投射至RVM区的神经纤维,这也是下行调节系统的重要组成部分。此阳性对照的结果是脊髓直接投射至RVM的投射关系存在的重要佐证。为了便于描述此类从脊髓上行投射至RVM区的神经元,研究者将之命名为“SNAPR——spinal cord neuron projecting to RVM”。进一步,研究者想要探究SNAPR神经元的相关性质。分别利用脊髓兴奋性和抑制性神经元的标记物,Lmx1bPax2,与SNAPR进行免疫荧光染色,结果表明,所有的SNAPR神经元均与Lmx1b共标,这提示SNAPR是位于脊髓的一类兴奋性神经元。为了能够实现对SNAPR神经元的特异性调控,以探究此类神经元对疼痛行为的影响,研究者在RVM区注射AAV2/retropAOV-hSyn-EGFP-2A-CRE病毒以实现标记SNAPR并使之能表达Cre酶,再在脊髓注射Cre重组酶诱导表达的兴奋性、抑制性化学遗传病毒以及表达白喉毒素的病毒,来探究特异性兴奋、抑制或杀死SNAPR神经元对疼痛行为的影响。通过进行机械痛、热痛和福尔马林实验,结果表明,激活SNAPR神经元可易化疼痛,抑制或杀死SNAPR神经元可抑制疼痛,SNAPR神经元对疼痛的发生有着重要的作用。

 

  为了进一步直接观察SNAPR神经元和RVMOn细胞的投射联系,研究者利用双光子技术来观察在体钙成像,以便特异性调控脊髓的SNAPR神经元后观察RVMOn细胞的电活动变化。由于双光子观察活体动物的深度最大可达到0.8mm左右,而RVM区位于延髓腹内侧区,研究者团队尝试从颈部入路,直接进行RVM区的观察。初步的研究结果发现,当给予足底疼痛刺激时,RVM区的神经元的确出现了钙成像信号反应,或许脊髓存在的这类SNAPR是外周伤害性信息传入的大门。

 

 


小结

 


  为了进一步直接观察SNAPR神经元和RVMOn细胞的投射联系,研究者利用双光子技术来观察在体钙成像,以便特异性调控脊髓的SNAPR神经元后观察RVMOn细胞的电活动变化。由于双光子观察活体动物的深度最大可达到0.8mm左右,而RVM区位于延髓腹内侧区,研究者团队尝试从颈部入路,直接进行RVM区的观察。初步的研究结果发现,当给予足底疼痛刺激时,RVM区的神经元的确出现了钙成像信号反应,或许脊髓存在的这类SNAPR是外周伤害性信息传入的大门。

 

 

 

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